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酶联斑点(Elispot)实验服务

产品型号:
更新时间: 2022-03-30
描述:提供商: 杭州研谨生物
服务名称: 酶联斑点(Elispot)实验服务
规格: 实验服务
价格: 1500元
收费标准/服务周期/提供结果:
欢迎咨询详谈,我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
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产品介绍

品牌其他品牌产地类别进口
应用领域医疗卫生,生物产业

酶联斑点(Elispot)实验服务

 

 

酶联斑点(Elispot) 技术概述:

酶联斑点(Elispot) 全名为酶联免疫斑点检测,英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(ELISA技术), 能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理,一句话概括就是:用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子,并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。

 

酶联斑点(Elispot)实验_副本.jpg

 

1、实验的准备工作

(1)设备与耗材:

①超净工作台;

5% CO2 37°C细胞培养箱;

P20P200P1000 微量移液器,

P300 8通道微量移液器,P300 12通道微量移液器,

Biosys ELISPOT Reader

P20P200P1000 枪头;

⑦多道移液器吸槽;

0.5mL, 1.5mL EP管。

 

(2)溶液配制

PBS:用分析纯试剂,Millipore级别的纯水配制, 高压灭菌。

PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意无菌操作。储存于20-25°C, 可存放一个月。

70%乙醇:分析纯乙醇70mL,加入Millipore级别的纯水至100mL

30%乙醇:分析纯230mL,加入Millipore级别的纯水至100mL.

⑤包被抗体(coating antibody, Primary antibody): U-Cytech说明书,加入双蒸水溶解。使用时,用PBS稀释50倍,每孔50uL

⑥封闭液:PBS将试剂盒中的封闭存储液(Blocking stock solution R)稀释10倍,每孔200uL

⑦抗体稀释液:注意,只是用来稀释检测抗体和酶联亲和素。用PBS将试剂盒中的稀释存储液(Dilutionbuffer R)稀释10

⑧检测抗体(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):U-Cytech说明书, 加入双蒸水溶解。使用时,用抗体稀释液稀释100倍,每孔100uL

⑨酶联亲和素(Streptavidin-HRP conjugate):U-Cytech说明书,加入双蒸水溶解。使用时,用抗体稀释液稀释100倍,每孔100uL

D AEC显色液: U-Cytech说明书, 用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC储存液(AEC stock solution),混合均匀后10ml每支分装,-200C保存。

使用时,解冻,每孔加入100pL.

PHA刺激物:将储存液(2mg/mlMurex)分装成20μL/EP管, -20*C长期冻存。 使用时,加入980μLU-Cytech无血清培养基(或者1640基本培养基),成为工作液(40μg/mL10倍终浓度),每孔加入10μL, 终浓度4μg/mL

U-Cytech无血清培养基:我们推荐无血清ELISPOT技术,它能排除血清的干扰,结果更加稳定可靠,背景也更好。如果没有,可以用含10%血清的1640培养基代替。

2ELISPOT标准操作程序

(1): ELISPOT包被程序设计好试验,把每个孔要加入的内容做成卡片,到时候就会从容很多。每孔加入15μL 70%的醇预湿30秒。

注意:

①未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的,经过乙醇润湿之后,颜色变暗,变成半透明状,很容易观察二者的区别。

②加乙醇的时候,枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方,注意枪头不到刺到PVDF膜。

③有时候,加入的乙醇挂在孔壁上, 这时要盖上板盖,轻轻叩击,让乙醇顺势滑落。乙醇一 旦接触到PVDF膜,就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜,使得膜的颜色和透明度发生变化。

15μL 是经过优化的体积,它能保证刚好完全浸润整块膜,而不会有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面,加深实验的背景。

⑤加入100μL去离子水洗涤三次,尽量减少乙醇的残留。

⑥按照试剂盒的使用说明,将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中,每孔加入50μL4°C包被过夜。

(次日)倾倒包被液,用PBS洗涤5次,最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干。

⑧加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液,37°C封闭1小时。

⑨倾倒封闭液,无须洗涤,直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤- -, 拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存数周。)

 

(2)第二天:铺细胞,加入刺激物,培养

①整个实验设置-组正对照(PHA刺激), 每一个细胞样品(-个捐献者或者实验动物)要设一个负对照

(不加刺激物),整块板还要加一个背景负对照(不含细胞,只加培养基和所有的检测试剂)

②填好实验卡片,用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复(想要有统计学的意义,每个细胞/刺激物设4个孔的重复)

④取出封闭好的板,准备加入细胞。如果是以前做的封闭,可以加入200μL U-Cytech无血清培养基,室温静置10分钟,倾倒,然后再重复- -次。

⑤按照实验卡片的安排,加入不同浓度的细胞,100uLwell, 细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入

细胞之后,不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散,实际情况刚好相反)。正对照的细胞浓度为1x105/well,实验组的样品细胞浓度请自行调整。

⑥加入100μLU-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。

⑦正对照孔加入10μL PHA,终浓度4ug/mL,该浓度能有效刺激IFN-V的分泌。

⑧加入实验者自己的刺激物(配制成10X终浓度,10uLwell)到实验孔。 加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀,实际上,通过扩散,刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。

⑨当加完所有的样品之后,盖上板盖,放入二氧化碳培养箱,37°C培养18-24小时。 注意在整个培养过

程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果,甚至开关培养箱的箱[ ]也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位,造成斑点的模糊、拖尾。

 

(3)第三天:培养后操作

①倾倒孔内的细胞及培养基。

②低渗法将细胞裂解,每孔加入200μL冰冷的去离子水,将板置于冰上冰浴10分钟。

③每孔用200μLPBST洗涤10遍,洗涤最后- 遍之后,将板倒扣在吸水纸上拍干。

④按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释检测抗体,每孔加入100μL生物素标记的检测抗体,37°C 1小时。

⑤每孔用200μL PBST洗涤5遍,洗涤最后一遍时, 将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。

 

注意:

①洗涤膜的背面,我们摸索出的办法是,在-个浅托盘中盛上干净的PBST,将膜板的底面浸入,轻轻摇晃几次即可。注意,-定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后,再合拢,盖上,不要伤害到膜。

②按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素,每孔加入100L, 37°C 1小时。

③每孔用200μL PBST洗涤5遍, 洗涤最后-遍时,将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。

④照试剂盒的说明,解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液,室温静置20-30分钟,注意避光。

⑤待斑点生长到适合的大小之后,以去离子水洗涤2遍,终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠,之后取下保护层,放在通风的地方,室温静置10-30分钟,让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内,防止膜发脆、破裂。

⑥将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自动读板仪内,调节好合适的参数,半点计数,并记录斑点的各种参数,作统计分析。


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