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产品名称:

多克隆抗体制备服务

产品型号:
更新时间: 2022-03-30
描述:服务名称: 多克隆抗体制备服务
提供商: 杭州研谨生物
规格: 实验代做服务
价格:8000元
收费标准/服务周期/提供结果:
欢迎咨询详谈,我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
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产品介绍

品牌其他品牌产地类别进口
应用领域医疗卫生,生物产业

多克隆抗体制备服务

 

 

 

 

<strong><strong><strong>多克隆抗体制备服务</strong></strong></strong>小图.jpg

 

 

多抗一般制备流程:完全抗原的准备- +兔子的免疫-→ 效价检测和终放- +抗体亲和纯化- +抗体的浓缩和保存。

 

具体实验步骤如下:

 

1.兔子的准备

 

挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只(2Kg) ,使其适应新的生活环境,至少稳定几天再进行首次取血、预采血(作阴性参照用)

1.1将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静;

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃);

1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位使血管膨胀;

1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(5ml血清);

1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口;

1.6将收集的血液置于37 C灭活30min,最后置于4" C过夜使其凝结释放血清;

1.7将凝结好的血液在10000r / min离心10min; h.收集 上清,即为血清。

 

兔子的免疫

2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果,后续免疫每次为100ug即可。

2.21m的佛氏完全佐剂与准备好的1m抗原充分混匀,呈乳白色; .

2.3小心从笼中取出兔子,织兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4兔疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。

 

3.效价检测

3.1 2个参照阴性参照为预取血血清,均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前

阳性血清

3.296孔板中每孔滴加100ul, 1ug/m抗原,于49C过夜, 也可以37°C孵育2小时。

3.3倒掉抗原溶液,每孔加入200u的封闭液, 49C过夜或者379C孵育2小时。

3.4倒去封闭液,在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37°C烘干并用封口袋封好于20°C存放。

3.5取包被好的96孔板,---孔加入阴性 参照液100ul,第二孔加入阳性参照液100ul,第三孔加入1:500的待测抗血清,后续各孔在此基础上倍比稀释,37°C孵育1 小时。

3.6倒掉液体,用洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入100uHRP标记的小鼠抗兔lgG (1: 2000稀释),于37°C孵育45分钟。

3.7倒掉液体,用洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入100uTMB底物(Sigma 单组份TMB ) 37°C孵育5-20分 钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)

3.8每孔加入50u的终止液(2N H2SO4), 在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。

抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。

 

抗体的纯化

 

4.抗体的亲和--亲和柱的制备

4.1 称取1mg CNBr- Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol/ L的盐酸中,4" C过夜使其充分溶涨,可获得3m溶涨胶。

4.2将凝胶转移入纯化柱中,用约20ml 2mmol / L的盐酸洗介质3次。

4.3用偶联缓冲液洗介质- -次,因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解,所以此步骤最好在几分钟内完成。

4.4将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中

4.5室温下轻轻混合摇动2-4小时,或4" C过夜,如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一-次。

4.6加入15m1 1% BSA溶液室温下孵育2小时或4" C过夜。

4.7用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上,每次15m以上h.

4.8抗原固相化完成,可用于纯化。

4.9若不立即使用或者使用后,用20%的乙醇封存。

 

5.抗血清的纯化和保存

5.1抗血清用PBS等体积稀释,5000-10000 / min离心15分钟,取上清.

5.210倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。

5.3将稀释好的抗血清10m加入平衡好的柱子中。

5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时,或4" C过夜

5.510倍体积的PBS清洗抗原柱,以洗去结合在柱子上的杂蛋白

5.62倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子,以得到特异性抗体

5.710倍体积PBS平衡柱子

5.820%的酒精封存柱子,4'C保存。

在得到洗脱的抗体后,经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐,使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值,所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度,添加40-50%甘油置于20^C可长期保存。

 

 

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