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染色质免疫沉淀技术包括哪三个独立的步骤?

时间:2022-08-03 浏览次数:36

  染色质免疫沉淀是一种用来研究生理状态下基因组内部蛋白质-DNA 相互作用的研究技术。是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。
  染色质免疫沉淀技术包括三个独立的步骤:
  1.固定,即在体内用甲醛固定DNA和蛋白质复合物,然后用化学(微球菌酶)或者机械(超声波)的手段将其随机切成一定长度的染色质小片段。
  2.免疫沉淀,即利用目的蛋白质或者目的蛋白质上标签的特异性抗体,通过抗原和抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体, 然后沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
  3.目的片段的纯化与检测,即经过热处理解交联,释放共沉淀的DNA;再将DNA片段纯化后,对沉淀的DNA样品进行检测。
  染色质免疫沉淀实验流程:
  甲醛处理细胞→收集细胞,超声破碎→加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合→加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合→洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联,纯化富集的DNA-片断→PCR分析。

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