讲一下明胶酶谱检测实验操作的流程

时间：2022-05-23 浏览次数：309

　　明胶酶谱检测实验法操作实验注意事项：

　　1.制备聚丙烯酰胺时应注意避免气泡。

　　2.明胶酶谱图的活性受钙离子，锌离子和pH值等因素影响。因此，缓冲液的制备应严格而准确，应尝试使用超纯水，并且应控制孵育温度。

　　3.用大梳子

　　4.孵育溶液的pH值应在7.5至7.6之间。如果复性的TRITON时间长，则会有絮状物，因此在实验过程中尝试使用新的配置。

　　5.请勿在二氧化碳培养箱中以37度进行培养，因为这会改变培养液的pH值，就像在普通培养箱中一样。

　　6.明胶应储存在4°C下，制备后1周内使用。

　　明胶酶谱检测实验操作流程如下：

　　1.按照自己蛋白酶的大小准备相应浓度的胶。记得在分离胶里面加入明胶储液，调成最后浓度为1% (1 mg/ml) 的胶。

　　2.把一份蛋白样品和一份2倍的上样缓冲液混合。千万不要加热，在室温中放置10分钟即可。

　　3.按常规操作点样，并且跑胶。跑胶的时间和电压取决于胶的浓度、电泳缓冲液的浓度和pH值。

　　4.跑完胶之后，把胶放在洗脱液中室温摇动孵育30分钟。一般来说两个mini gel用100ml就足够了。

　　5.把洗脱液倒掉之后，换上孵育液室温摇动孵育30分钟。换新的孵育液之后，至少在37度下再孵育一个小时。如果能过夜孵育的话，敏感度会有所提高。大家可以实验性的来调节孵育时间来找到适合自己的条件。

　　6.用考马斯亮蓝R-250染色30分钟。这里需要提醒一下，最好用5 % (w/v) 的溶液来代替常用的0.1 % (w/v) 来增加对比度。使用考马斯亮蓝脱色液脱色之后，就可以观察蛋白酶的活性了。有活性的地方，就会看到白色透明的条带，因为明胶底物被分解掉了，背景则是深蓝色。