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技术文章

喹诺酮残留(0.1ppb、血清)

时间:2022-09-15 浏览次数:58

喹诺酮类

快速检测试剂盒说明书

一、原理

    试剂盒采用间接竞争ELISA方法,在微孔条上预包被偶联抗原,样本中的残留物喹诺酮类药物和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗喹诺酮类药物抗体,加入酶标记物后,用TMB底物显色,样本吸光值与其所含残留喹诺酮类药物的含量成负相关,与标准曲线比较即可得出相应残留物喹诺酮类药物的含量。

二、试剂盒特性

试剂盒灵敏度:      0.1ppb

孵育温度:          25℃

孵育时间:          30min15min

样本检测下限

组织 、血清 ········································  1ppb

交叉反应率

恩诺沙星(ENR)   ··························    100%

环丙沙星(CIF)   ····························    100%

氧氟沙星(OFL)    ··························    60%

奥索利酸(OXO)  ···························  116.86%

达氟沙星(DAN)  ···························  102.63%

诺氟沙星(NOR)  ···························  148.65%

洛美沙星(LOM)  ··························   86.24%

培氟沙星(PEF)   ··························  156.60%

依诺沙星(ENO)  ···························   98.97%

氟喹酸(FLU)    ···························   96.73%

麻保沙星(MAR)  ··························  110.63%

氨氟沙星(AMI)  ···························   98.86%

那氟沙星(NAD)  ···························   56.81%

样本回收率

组织、血清 ·································     85±20%

三、试剂盒组成

1

微量测试孔

每条8孔,一板12

2

标准液×6

1ml/瓶)

0ppb

0.1ppb

0.3ppb

0.9ppb

2.7ppb

8.1ppb

3

酶标记物

7ml

红色帽

4

抗体工作液

7ml

蓝色帽

5

底物A

7ml

白色帽

6

底物B

7ml

黑色帽

7

终止液

7ml

黄色帽

8

20X浓缩洗涤液

40ml

白色帽

9

20X浓缩复溶液

50ml

透明帽

四、所用仪器、试剂

具备的仪器微孔酶标仪、打印机、均质器 、振荡器、离心机、刻度移液管、天平(感量0.01g

微量移液器:单道 20200ul、单道1001000ul、多道 250 ul

五、样本前处理步骤

样本处理前须知

处理任何样本时,都必须注意:

(a) 实验中必须使用一次性吸头,在吸取不同的试剂时要更换吸头。

(b) 实验之前须检查各种实验器具是否干净,必要时可对实验器具进行清洁,以避免污染干扰实验结果。

样本前处理需配制:

配液1  样本复溶液 

20X浓缩复溶液用去离子水按1191份浓缩复溶液+19份去离子水)进行稀释。

样本处理:

a组织样本处理方法

1、称1.0±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中;

2加入10ml样本复溶液,振荡3min4000r/min以上,15℃离心10min

3取上清50µl液体用于分析。

     样本稀释倍数:10

b血清样本处理方法

1、 50µl澄清的血清,加入450µl 样本复溶液混合,混匀30S(如果血清样本浑浊,将样本于104000r/min以上离心10min,分离出血清或过滤血清,直至得到澄清的样本);

2、 50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:  10  

六、 酶标免疫分析程序:

测定前应须知:

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温(20-25℃)。

2、 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃

3、 ELISA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、 所有恒温孵育过程,避免光线照射,用盖板膜盖住微孔板。

操作步骤:

1、 将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出,置室温(20-25℃)平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀

2、 按需要取出微孔条及板架,将不用的微孔板重新密封,保存于2-8℃,不要冷冻

3、 配液:将40ml浓缩洗涤液(20倍浓缩)用去离子水按照119稀释(1份浓缩洗涤液+19份去离子水),或按所需用量配制洗涤液。

4、 编号:将样本和标准品对应微孔按序编号,每个样本和标准品均需做2孔平行,并记录标准孔的样本孔所在的位置。

5、 加标准品/样本50µl /孔,然后加酶标记物50μl/孔,再加入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板,25℃环境反应30min

6、 用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次,每次浸泡15-30秒,拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

7、 显色:每孔加入底物A50µl再加入底物B50µl,轻轻振荡混匀,25℃环境避光显色15min

8、 测定:每孔加入终止液50µl,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据),测定吸光度值(OD值)。

七、结果判定

结果判定有两种方法,粗略判定可用第1种方法,定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含喹诺酮类药物量成负相关。

1、粗略判定:

    用样本的平均吸光度值与标准品比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.238, 样本2的吸光度值为0.946,标准液吸光度值分别是:0ppb1.8450.1ppb1.5420.3ppb1.1300.9ppb0.6352.7ppb0.3268.1ppb0.156。则样本1的浓度范围是2.7ppb - 8.1ppb;样本2的浓度范围是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中喹诺酮类药物的实际浓度。

2、定量分析

1)百分吸光率的计算,标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值,再乘以100%,即

百分吸光%)=

B

×100%

B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

2)标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标,以喹诺酮类标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中喹诺酮类药物实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样本的准确、快速分析。

八、 注意事项

1、 室温低于25℃或试剂及标本未回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会伴随着标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀,否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸,避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒;稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值变化;不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋重新密封;标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之。标准品1的吸光度值小于0.5时,表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒反应温度为25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1、 储藏条件:试剂盒于2-8℃保存,不要冷冻。

2、  期:该产品有效期为1年,生产日期见包装盒。

提示:酶标板真空包装袋若有漏气,酶标板仍然正常有效,不影响实验结果,请放心使用。

 

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