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蛋白双向(2-D)电泳使用的注意事项

时间:2022-08-17 浏览次数:34

  蛋白双向(2-D)电泳是将蛋白质等电点和分子量两种特性结合起来进行蛋白质分离的技术, 因而具有较高的分辨率和灵敏度, 已成为蛋白质特别是复杂体系中的蛋白质检测和分析的一种强有力的生化手段。蛋白双向电泳的第一向为等电聚焦,根据蛋白质的等电点不同进行分离; 第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后, 可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
  蛋白双向(2-D)电泳主要注意事项:
  1、一向聚焦与二向电泳之间需要平衡,时间视蛋白质的性质而定,一般为10min,最多不超过15min。
  2、过量的上样量会引起双向图形畸形,特别在一向聚焦时,当样品浓度超过5mg时,则蛋白质凝聚和沉淀,使二向时产生水平和垂直条纹。
  3、含尿素的试剂均应避免过高的温度处理,一般不要超过30℃,否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
  4、第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱,因此聚焦完毕进行平衡前,用双蒸馏水冲洗胶条,以除去残留的去污剂。
  5、双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要,如果接触不好或者两者之间留有气泡,则导致转移时分子扩散。
  6、双向电泳中的条纹现象是常见的问题。水平条纹可能与一向电泳时间不够,聚焦不好有关,或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致;纵向条纹则表明样品没完全溶解,这可以通过调整样品量,增加电泳时间,改善样品的溶解状态,同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。

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