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大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作指南

时间:2022-06-13 浏览次数:195

大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书

 

 

MaxiGel Extraction Kit

号:  K0518

  存:  室温

组分说明

Cat.No.                         K0518

KitSize                          50

BufferPG                       100ml

BufferPS                        15ml

BufferPWconcentrate          10ml

BufferEB                        10ml

SpinColumnDL                  50

CollectionTube2ml          50

产品简介

     本试剂盒采用新型硅基质膜技术,通过快速,简单的结合-洗涤-洗脱步骤可从大量普通或低熔点琼脂糖凝胶中回收纯

50bp-50kb DNA 片段,溶胶速度快,每个吸附柱最高可吸附 30 μg DNA,纯化过程中有效去除引物、核苷酸、

酶、矿物油、琼脂糖等杂质,获得高纯度,完整性好的 DNA 片段,回收率高达 90%。本试剂盒回收纯化的 DNA 可直接用

于测序、连接和转化、酶切、标记、体外转录等分子生物学实验。

注意事项

1..第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在BufferPW中加入无水乙醇。

2.使用前请检查BufferPG是否出现结晶或者沉淀,如有结晶或者沉淀现象,可在37℃水浴几分钟,即可恢复澄清。

3.电泳时最好使用新的电泳缓冲液,以免影响电泳和回收效果。

4.切胶时,紫外照射时间应尽量短,以免对DNA造成损伤。

5.回收率与初始 DNA 量和洗脱体积有关。

6.所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心。

自备:无水乙醇,离心管

 

操作步骤

 

1. 将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分),放入干净的离心管(自备)中,称取重量。 

注意:若胶块的体积过大,可将胶块切成碎块。

2. 向胶块中加入3倍体积Buffer PG;当琼脂糖凝胶浓度>2%时,建议使用6倍体积BufferPG(如凝胶重为100mg,其体积可视为100μl,依此类推)。

3. 50℃孵育10分钟,其间不断温和地上下颠倒离心管,以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块,可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟,直至胶块完全溶解。

注意:1)在胶充分溶解后检测pH值,若pH值大于7.5,可向含有DNA的胶溶液中加10-30μl 3M醋酸钠(pH5.0)将pH值调到5-7

      2)胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在较高温度时结合 DNA 的能力较弱。

4.(可选步骤)当回收片段<500bp>4kb时,应加入1倍胶体积的异丙醇,上下颠倒混匀(如凝胶为100mg,则加入100μl异丙醇)。

注意:当回收片段为500bp-4kb时,加入异丙醇不会影响回收率。

5.柱平衡:向已装入收集管(CollectionTube)中的吸附柱(SpinColumnDL)中加入200  μl Buffer PS12,000rpm~13,400×g)离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。

6.将步骤3或者步骤4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

注意:吸附柱容积为700μl,若样品体积大于700μl 可分批加入。

7.(可选步骤)向吸附柱中加入500μlBufferPG12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

注意:如果后续实验用于直接测序、体外转录或显微注射,推荐用此步骤以除去所有凝胶。8. 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

9. 注意:如果纯化的DNA用于盐敏感的实验(例如平末端连接或直接测序),建议加入BufferPW静置2-5分钟再离心。12,000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。

注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。

10.  将吸附柱放到一个新离心管(自备)中,向吸附膜中间位置悬空滴加100 μl Buffer EBpH 8.5),室温放置2分钟。12,000rpm离心2分钟,收集DNA溶液。-20℃保存DNA注意:1 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液,应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)。

2 为了提高DNA的回收量,可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中,重复步骤10

3 洗脱体积不应小于50μl,体积过少会影响回收效率。

4 如果使用TE洗脱,需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。

5)回收大于10kbDNA片段时,BufferEB应在50℃水浴中预热,适当延长吸附和洗脱时间,可增加回收效率。

 

 

 

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