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大量DNA产物纯化试剂盒操作步骤

时间:2022-06-13 浏览次数:142


版本号:08152012

MaxiDNA Purification Kit

大量 DNA 产物纯化试剂盒

目录号:  K0517

  存:  室温

组分说明

Cat.No.                                 K0517

KitSize                                   50

BufferPB                               60ml

BufferPS                                  15ml

BufferPW(concentrate)         10ml

BufferEB                                  10ml

SpinColumnDL                       50

CollectionTube(2ml)           50

产品简介

      本试剂盒采用新型硅基质膜技术,通过快速简单的结合-洗涤-洗脱步骤即可从大量的 PCR 产物或酶反应液(酶切,连接,探针标记等)中纯化 50 bp-50 kb 的 DNA 片段,纯化过程中可有效去除引物、寡核苷酸、酶等杂质,从而获得高纯度,高浓度,完整性好的 DNA 片段,回收率高达 90%。本试剂盒回收纯化的 DNA 可直接用于测序、连接和转化、标记、体外转录等分子生物学实验。

注意事项

1.本试剂盒可无选择性的回收溶液中所有 DNA 片段,如需选择性回收特定片段,同时去除其他不同大小片段,请选择我公司的胶回收试剂盒(K0524, 加 K2302,K0518 或 K0526)。

2.--次使用前应按照试剂瓶标签的说明在BufferPW中加入无水乙醇。

3.使用前请检查BufferPB是否出现结晶或者沉淀,如有结晶或者沉淀现象,可在37℃水浴几分钟,即可恢复澄清。

4. 回收率与初始DNA量和洗脱体积有关。

5. 所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

自备:无水乙醇,离心管

 

操作步骤

1.估计DNA反应液的体积,加入5倍体积的Buffer PB,充分混匀(如DNA反应体系为100µl,则加入500µlBufferPB,无需去除石蜡油或矿物油)。

注意:在加入BufferPB后检测溶液的pH值,若pH值大于7.5,可向其中加入10-30 μl 的3M醋酸钠(pH5.0),从而将pH值调到5-7。

2.柱平衡:向已装入收集管(CollectionTube)中的吸附柱(SpinColumnDL)中加入200  μl Buffer PS,12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。

3.将步骤1中所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

注意:吸附柱容积为700µl,若样品体积大于700µl可分批加入 。

4. 向吸附柱中加入650 µl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,

5. 将吸附柱放回收集管中。

6.注意:如果纯化的DNA用于盐敏感实验(例如平末端连接实验或直接测序),建议加入BufferPW后静置2-5分钟再离心。12,000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。

注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。

7. 将吸附柱放到一个新离心管(自备)中,向吸附膜中间位置悬空滴加100 µl Buffer EB(pH 8.5),室温放置2分钟。

8. 12,000rpm离心1分钟,收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

 

注意:1)洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液,应保证其pH值在7.0-8.5之间(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)。

2)为了提高DNA的回收量,可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中,重复步骤6。

3)洗脱体积不应小于50μl,体积过少会影响回收率。

4)如果使用TE洗脱,需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促应。

5)回收大于10kb的DNA片段时,BufferEB应在50℃水浴中预热,适当延长吸附和洗脱时间,可增加回收效率。

 

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