禽流感病毒H5N1亚型核酸检测步骤

禽流感病毒H5N1荧光PCR检测试剂盒

禽流感病毒H5N1亚型核酸检测试剂盒

（RT-PCR荧光探针法）

【产品概述】

本试剂盒针对AIV-H5N1高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含AIV-H5N1基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

【试剂盒组成】

【储存条件及有效期】

-20℃避光保存，避免反复冻融，有效期6个月。

【适用仪器】

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等荧光定量PCR仪。

【样本采集、存放及运输】

u 样本采集：各类型样本按照常规方法采集；

u 存放：样本在2~8℃条件下保存应不超过72h，-70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）；

u 运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

【自备试剂】

核酸提取试剂，如QIAGEN公司的 RNA核酸提取试剂盒，也可选择其他合适的核酸提取产品。

【使用方法】

注：所有试剂使用前需*解冻，混合均匀，6,000rpm离心数秒后使用。

1. 样本处理（样本处理区）

待检样本的核酸提取可采用病毒RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等，具体提取方法请参照相关说明书；阳性对照及阴性对照无需提取，可直接使用。

2. 扩增试剂准备（PCR前准备区）

取N个（N=阴性对照+待检样本+阳性对照）PCR反应管，每管分别加入PCR反应液17.5 μl、混合酶液2.5 μl (也可根据每头份用量计算N+1份PCR反应液、混合酶液所需总量，两者混匀离心后分装20 μl至单个PCR反应管)。

将所有PCR反应管于6,000rpm离心30s，转移至样本处理区。

3. 加样（样本处理区）

在上述的PCR反应管中分别加入待检样本RNA提取物、阴性对照和阳性对照各5 μl，盖紧管盖，于6,000rpm离心10s，转移至扩增区。

* 注意事项：建议加样顺序是阴性对照、待检样本、阳性对照。

4. PCR扩增（扩增区）

1)仪器设置（以ABI Prism 7500为例）

将PCR反应管放入PCR仪内，按照对应顺序设置阴性对照(NTC)、阳性对照(Standard)及待检样本(Unknown)。

FAM通道采集AIV-H5荧光信号，HEX通道采集AIV-N1荧光信号。Quencher Dye为None，参比染料(Passive Reference)为 None。

2) 扩增程序

42℃ 10min

95℃ 3min

95℃  5sec

55℃  40sec

95℃  5sec

55℃  40sec

40Cycles中55℃采集荧光信号，反应体系为25 μl。

【结果分析条件设定】

u 基线（Baseline）设定：应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域（所有样本荧光信号无较大波动），起始点（Start）应避开荧光采集起始阶段的信号波动，终止点（End）应比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1~3个循环，建议基线设为3~15。

u 阈值(Threshold)设定：将阈值线设定在刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

【质控标准】

1.   阴性对照的检测结果应为阴性，Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期；

2.   阳性对照的检测结果应为阳性，有典型S型扩增曲线或Ct值≤35；

3.   以上要求需在一次实验中同时满足，否则该次实验视为无效。

【结果判断】

1.   阳性：标本检测结果Ct值≤35并有明显指数增长期；

2.   可疑：有明显的指数扩增期，且35＜Ct≤38，此时样本为可疑样本；对于可疑样本建议复核一次，若复核结果Ct≤38且有指数扩增期，则判定为阳性，否则判定为阴性；

3.   阴性：无指数扩增期，Ct＞38或无Ct值均判定为阴性样本。

【对检验结果的解释】

【试剂盒使用注意事项】

1.   有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。

2.   本试剂盒仅用于体外检测。

3.   实验请严格分区操作：

第一区：PCR前准备区 — 准备扩增所需试剂；

第二区：样本处理区 — 待测样本和对照品处理；

第三区：检测区 — PCR扩增检测。

4.   各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后即请清洁工作台；

5.   试剂盒内各试剂使用前，充分融化后请稍事离心。

6.   在－20℃保存的样本裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。

7.   分装有反应液的检测管装入密实袋内再转移至样本区。

8.   加样时应使样品*落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快封上检测管盖。

9.   扩增完毕立即取出检测管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。

10.   反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

11.   实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

12.   工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。

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